Описание SGE метода анализа ізоензимів подсолнечника (Helianthus annuus L.)

1. Количество ростков для экспертизы:

— Для проверки формулы:

10 ростков каждой инбредной линии 4 ростка простых гибридов 10 ростков трехлинейных гибридов

— Для экспертизы на отличие, однородность и стабильность:

не меньше 40 ростков для инбредных линий, гибридов и свободно запилюваних сортов.

2. Приборы и оборудования

Любая соответствующая горизонтальная електрофорезна система может быть использована при условии, что гели удерживают за температуры 40С. Рекомендованная толщина геля 10 мм. Энергию нужно использовать такую, которая способная поддерживать постоянное снабжение напряжения на выходе.

3. Химикаты

Все химикаты должны быть пригодными для химических анализов наивысшего качества.

3.1 Химикаты для экстракции ензимів: три — (гідрооксіметил) амінометан (три); соляная кислота;

В — меркаптоетанол.

3.2 Химикаты для електрофорезу: бромфенол синий;

лимонная кислота моногидрат;

L-гістидин;

крахмал гідролізований для електрофорезу (Sigma S-4501 или равноценный).

3.3 Химикаты для окраски ензимів:

95% етанол;

этилендиамин тетра-уксусной кислоты, двонатрієва соль (EDTA Na2);

D-Фруктоза 6-фосфат, двонатрієва соль;

A-d-глюкоза 1-фосфат, моногидрат, двонатрієва соль; глюкоза 6-фосфат дегідрогеназа (Sigma G5885); соляная кислота (HCI); хлорид магния гексагідрат (Mgci2, 6H2O);

Dl-Яблочная кислота, натриевая соль; диметилтіазол діфенол тетразол (МТТ);

В-нікотинамід аденін дінуклеотид фосфат (NADR); нітро-синий тетразол (NBT);

6-фосфоглюконова кислота, тринатрієва соль дігідрат;

феназін цель сульфат (PMS);

гидрооксид натрия (Naoh);

три — (гидра метил) амінометан (три).

4. Растворы

4.1 Раствор для экстракции: 0.1М три HCI (ph 7.2) + 0.2%-меркаптоетанол (v/v).

4.2 Буфера для електрофорезу

4.2.1 Буфера для SGE ph 6,5

4.2.1.1 Основной раствор: 0, 364 M L-Гістидин лимонный:

50,44г L-Гістидин;

8, 34 г моногидрат лимонной кислоты смешать с 1л где-ионизированной воды.

4.2.1.2 Текучий буфер: 0,072 M L-Гістидин лимонный рН 6.5 (основной раствор разбавлен 1:5)

400 мл основного раствора (4.2.1.1) смешать с 2л где-ионизированной воды.

4.2.1.3 Гелевий буфер: 0,024M L-Гістидин лимонный (основной раствор разбавлен 1:5) 80 мл основного раствора (4.2.1.1)

смешать с 1200 мл где-ионизированной воды.

4.2.2 Буфер для SGE рн 5.7

4.2.2.1 Текучий буфер: 0,067 M L-Гістидин лимонный рН 5.7 20,18 г L-Гістидину

8,34 г Моногидрата лимонной кислоты смешать с 2 л где-ионизированной воды.

4.2.2.2 Гелевий буфер: 0, 011 M L-Гістидин лимонный (Текучий буфер разбавлен 1:6) 100 мл текучего буфера (4.2.2.10) смешать с 1200 мл где-ионизированной воды.

4.2.2.3 Раствор бромфенолу синего

50 мг бромфенолу синего растворяют в 100 мл где-ионизированной воды.

4.3 Фарбуючі растворы

4.3.1 Основные растворы

4.3.1.1 1М три-HCI ph 7.5:

121.1 г три-HCI, смешать с 1л где-ионизированной воды и устанавливают рн 7,5 с 50% HCI.

4.3.1.2 1 М три-HCI рн 8.5:

121.1 г Три, смешать с 1л где-ионизированной воды и устанавливают рн 8,5 с 50% HCI.

4.3.1.3 МТТ раствор:

1.0 г МТТ смешать с 100 мл где-ионизированной воды.

4.3.1.4 NBT раствор:

1.0 г NBT смешать с100 мл где-ионизированной воды.

4.3.1.5 PMS раствор:

200 мг PMS смешать с100 мл где-ионизированной воды.

4.3.1.6 Mgci? раствор:

10 г гексагідрату хлорида магния смешать с100 мл где-ионизированной воды.

4.3.1.7 Соль яблочной кислоты:

2.5 г DL- яблочной кислоты

смешать с50 мл где-ионизированной воды и установить рн 8,0 с 1М Naoh.

4.3.2 Фарбуючі растворы

4.3.2.1 МЕ крася растворы:

100 мл 0,1М три-HCI, рн 7.5 (4.3.1.1 разбавленный 1:10);

400 мл соли яблочной кислоты (4.3.1.7);

1 мл NBT раствора (4.3.1.4);

1 мл PMS раствора (4.3.1.5);

1,8 мл Mgci2 раствора (4.3.1.6);

17.5мг NADP.

4.3.2.2 PGD + PGI фарбуючий раствор:

100 мл 0.1 М три-HCI, рн 7.5 (4.3.1.1 разбавленный 1:10);

100 мг D — фруктозы 6- фосфат Na2 соль;

60 мг 6-фосфоглюконової кислоты Na3 соль;

10 мг NADP;

1 мг МТТ раствора (4.3.1.3);

1.5 мл PMS раствора (4.3.1.5);

1мл Mgci2 раствора (4.3.1.6);

40 единиц глюкоза-6-фосфат дегідрогеназа (SIGMA G 5885).

К PGI, не включать глюкоза-6-фосфат дегідрогеназну кислоту.

К PGD, не включать фруктоза-6-фосфат дегідрогеназну или глюкоза-6-фосфат дегідрогенази.

4.3.2.3 Sh DH фарбуючий раствор:

100 мл 0.2 М три-HCI, рн 8,5 (4.3.1.2 разбавленный 1:5);

50 мг shikimic кислоты;

1 мл МТТ раствора (2.3.1.3);

1.25 мл PMS раствора (4.3.1.5);

12 мг NADP.

4.3.2.4 PGM фарбуючий раствор:

100 мл 0,1 М три HCI, ph 8.5 (4.3.1.2разбавленный 1:10);

150 мг a — D — Глюкоза 1-фосфат 1Н2 ОБ, Na2 соль;

150 мг EDTA, Na2;

10 мг NADP;

1.5 мл МТТ раствора (4.3.1.3);

1.0 мл PMS раствора (4.3.1.5);

4 мл Mgci2 раствора (4.3.1.6);

40 единиц глюкоза-6-фосфат дегідрогенази.

5. Процедура

5.1 Экстрагирование ензимів

Ростки получают за прорастания на смоченной бумаге в темноте за т-ри 25°С на протяжении 2-3 суток. Шелухи удаляют, а семядоли измельчают при 4°С с помощью товкачика и берут 1,5 мл, помещают в буфер для экстрагирования (300 мл) (4.1). Экстракт можно сохранять за температуры -30…-80°С.

5.2 Приготавливание геля

Гель готовят за день к экстрагированию.

Готовят два 12.5% крахмальных гелей (18*18*1см) в следующем порядке: 128 г крахмала перемешивают в 1020 мл буферного геля (4.2.1.3 или 4.2.2.2) в 1000 мл и нагревают до 78°С у колбе Бюхнера. Смесь дегазируют струей воды на протяжении 30 секунд. Гель наливают в форму, как описано в руководстве из использования оборудования. Нужно избегать образование пузырьков. Гель охлаждают к комнатной температуре на протяжении 45 минут, потом помещают в холодильник на 1 час. Г эль завертывают в полиэтиленовый пакет и сохраняют за 4°С на протяжении 1 часа перед использованием.

5.3 Електрофорез

5.3.1 Каждую электродную секцию заполняют к соответствующему объему текучим буфером (4.2.1.2 или 4.2.2.1), предварительно охлажденным до 4°С. Полиэтиленовую пленку поднимают и делают два поперечных разреза в геле 3 см и 4 см из края формы ( со стороны катода). Пласт геля в 1 см снимают и проводят экстрагирование таким образом:

экстракт (5.1) розморожують и абсорбируют лентой фильтровальной бумаги (1, 5 мм* 20 мм, ватман № 3). Ленты вставляют в гель плотно к первому разрезу. Одну ленту замачивают в бромфенолі синему (4.2.2.3) (фарбуючий маркер) с каждой стороны геля. Пласт геля осторожно возвращают. Каждый гель обертывают поліетиленом. Два пласта геля с экстрактами со стороны катода располагают на двух электродах буферной секции и помещают в холодильную камеру при 4°С. Електрофорез проводят за 4°С у направления аноду. Через 15 минут экстракции подают первое напряжение, удаляют ленты и увеличивают напряжение. Постоянное напряжение поддерживают во время каждой фазы.

Условия проведения електрофорезу заносят к Таблице.

Буферная система

Постоянное напряжение

Отрезок пути в бром феноле синему

Продолжительность движения

Гістидин лимонный рН 5.7

260 V на 15 минут потом 290V

15см

5 часов

Гістидин лимонный рН 6.5

240 V на 15 минут потом 280V

11см

5 часов

SGE с рн 5.7 должны быть использован для выявления ME, PGD и PGI. Ізоензими PGM и Shdh нужно выявлять с помощью SGE с рн 6.5.

5.4 Крашение ензимів

После выключения тока гель разрезают по горизонтали на пластинки завтовшки 1 мм стальным проводом или леской. Верхняя пластинка удаляется. Отдельные пластинки геля ставят в термостат за 37°С, в темряві в таких растворах:

для ME: раствор 4.3.2.1 время пребывания в термостате 15 часов

для PGD и PDI: раствор 4.3.2.2 время пребывания в термостате 1 час

для SHDH: раствор 4.3.2.3 время пребывания в термостате 1 час

для PGM: раствор 4.3.2.4 время пребывания в термостате 1/2 часа

После этого пластинки геля всполаскивают в где-ионизированной воде и фиксируют в 40% раствору етанолу. Для продолжительного хранения и успешного использования выполняют процедуры: высушенный гель помещают между двумя полиэтиленовыми пленками, увлажненными в 5%- ному раствору глицерина, или сохраняют в герметичном полиэтиленовом пакете.

9. Литература

Документ UPOV TG/81/6, 2000.

10. Техническая анкета

ТЕХНИЧЕСКАЯ АНКЕТА Страница {1} с {3}

Номер ссылки:

Дата представления заявки:

(не заполняется Заявителем)

ТЕХНИЧЕСКАЯ АНКЕТА заполняется в связи с заявкой на п

рава селекционера на сорт растения

1. Предмет Технической анкеты

1.1 Ботаническое название

Helianthus annuus L.

1.2 Общепринятое название

Подсолнечник одногодичный

2. Заявитель

Имя

Адрес

Телефон №

Факс №

E-mail адрес

Селекционер (если он не Заявитель)

3. Предложенное название и рекомендация селекционера

Предложенное название (если есть) Рекомендация селекционера

#4. Информация относительно схемы селекции и размножение сорта

4.1 Схема селекции

(информация относительно схемы селекции)

4.2 Метод размножения сорта

(информация относительно метода размножения сорта)

(информация относительно метода размножения гибридных сортов)

5. Признаки сорта должны быть обозначены (номер в дужках Методиках; просим выделить наиболее соответствующий код)

касается соответствующего признака в

Признаки

Сорта-Эталоны

Коды

5.1

(4)

Листок: зеленый цвет

светлый

воздержанный

темный

Н 52.9.1.1, Вранац НА 821, Дарий, Завет НА 303

3 [ ] 5 [ ] 7 [ ]

5.2

(5)

Листок: пухирчатість

отсутствующая или очень слабая

слабая

воздержанная

сильная

очень сильная

HA 342, RHA 273, Президент Местный 4, Дарий HA 291, Стиль, Харьковский 7 HA 303, RHA 361, Трудовик, Загадка

1 [ ]

3 [ ] 5 [ ]

7 [ ]

9 [ ]

ТЕХНИЧЕСКАЯ АНКЕТА

Страница {2} с {3}

Признаки

Сорта-Эталоны

Коды

5.3

(14)

Время цветения

очень ранний ранний

средний

поздний

очень поздний

HA 302, Завет RHA 273, Скороспелый, Дарий RHA 274, Символ RHA 271, Харьковский 7 RHA 361 , Армавирский 3497, Местный 4

1 [ ]

3 [ ] 5 [ ]

7 [ ]

9 [ ]

5.4

(19)

Язычковые цветки: за цветом

желтовато-белые светло-желтые умеренно желтые

желтый^-желтые-оранжево-желтые

оранжевые

пурпуру

красно-коричневые

пестрые

HA 89, Харьковский 7, Дарий RHA 361,

Местный 1 CM 587, RHA 295

1 [ ] 2 [ ]

3 [ ]

4 [ ]

5 [ ]

6 [ ]

7 [ ]

8 [ ]

5.5

(28)

Растение: за высотой

очень низкая

низкая

средняя

высокая

HA 379 HA 291 RHA 801, Скороспелый H 52.9.1.1, Дарий

1 [ ] 3 [ ]

5 [ ] 7 [ ]

5.6

(29)

Растение: галуження ( за исключением галуження, вызванного условиями среды)

отсутствующее

имеющееся

HA 89, Харьковский 7, Дарий, Вранац RHA 271

1 [ ] 9 [ ]

5.7

(39)

Семянка: полосатость на краях

отсутствующая или очень

слабая

слабая

очень сильная

RHA 273, Сапфир H 52.9.1.1, Вранац HA 89, Дарий

1 [ ] 2 [ ] 3 [ ]

5.8

(40)

Семянка: полосатость между краями

отсутствующая или очень

слабая

слабая

очень сильная

RHA 273, Дарий RHA 293, Анонс HA 89, Флокс

1 [ ] 2 [ ] 3 [ ]

6.

Просе к то есть най тизу

Іодібні сорта и отличительности между этими сортами

едим использовать эту таблицу и строку комментариев для предоставления информации что — го, как Ваш сорт — кандидат отличается от сорта (или сортов), которые, на Ваш взгляд, более подобными. Эта информация может помочь учреждению провести свою експер — ча отличие более эффективным методом.

Название(и) сорта(ів) подобный Вашему сорту-кандидата

Признак(и), по которым Ваш сорт-кандидат отличается от подобных сортов

Опишите выявление признаков(и) подобного(их) сор — ту(ів)

Опишите выявление признаков(и) Вашего сор — ту-кандидата

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *